提高肌苷产量的促进剂及其添加方法,涉及肌苷,提供提高肌苷产量的促进剂及其添加方法。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少一种:次黄嘌呤,NaF,CaCl
1.提高肌苷产量的促进剂,其特征在于,所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物:次黄嘌呤,NaF,CaCl₂,葡萄糖酸钙,柠檬酸钠;在培养基中的浓度为:次黄嘌呤为0.15%,NaFxa02xa0mg/L,CaCl₂xa010xa0mg/L,葡萄糖酸钙xa015xa0g/L,柠檬酸钠3xa0g/L。技术领域
本发明涉及肌苷,特别涉及提高肌苷产量的促进剂及其添加方法。
背景技术
肌苷,英文为Inosine,又称之为次黄嘌呤核苷,是次黄嘌呤与核糖的缩合物,其化学名称为9-β-D-呋喃核糖次黄嘌呤。其中,在次黄嘌呤碱基N-9的位置上,通过糖苷键的形式联结了以呋喃形式存在的核糖的第1位碳原子。肌苷的分子式为C₁₀H₁₂N₄O₅,相对分子质量为268.23。常见的肌苷为白色针状结晶或呈无水粉末状固体,无臭略带苦味,常温常压下熔点为218°C,易溶于水,20°C时在水中的溶解度约为2.065,在饱和水溶液中约含肌苷15xa0g/L;也易溶于稀盐酸或氢氧化钠,微溶于乙醇,不溶于氯仿。肌苷在食品和医药领域有着非常广泛的应用价值。在食品领域中,肌苷是食品中美味的呈味物,其含量常常作为衡量食品新鲜度的特征指标之一。肌苷是各种调味食品,例如味精、酱油等的营养助鲜剂,同时也是食品工业中有效增鲜剂5"-肌苷酸、呈味核苷酸二钠的主要原料之一。在医药领域中,肌苷可以直接透过细胞膜,是一种细胞复活剂,具有刺激细胞、增强细胞代谢等功能。医学上通常用于预防和治疗心脏和肝脏等器官的细胞损伤,有助于肝功能恢复正常,并能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用,是治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等的良效药物。由于其毒副作用小而且安全性较好,同时也是抗生素生产的原料。此外,异丙肌苷是一种正在开发的肌苷衍生物,除具有抗病毒、增强记忆作用外,还具有延缓衰老的功能。肌苷的生产方法基本上可以分为3大类:化学分解法、酶解法以及微生物发酵法。化学合成法生产肌苷设备条件要求较高,合成肌苷工艺比较复杂,而且由于大量使用有机溶剂,造成严重的环境污染,因而被限制投入生产。酶解法由于生产成本较高且造成一定程度的资源浪费,影响其在肌苷工业的大规模生产。微生物发酵法生产肌苷的成本较低,对环境无污染且效益较高,因此,微生物发酵法是目前生产肌苷的主要采用方法。近年来,随着韩国、日本等国家肌苷产业的不断发展,对我国肌苷市场形成了巨大的冲击,国内肌苷发酵产业所面临的挑战日益严峻。因此,优化肌苷发酵方法,提高肌苷得率,降低生产成本,进而提升我国肌苷的市场竞争力,成为肌苷发酵行业亟待解决的问题。目前尝试了很多提高肌苷产量的方法,主要包括菌种选育、基因工程改造、发酵条件的优化等等。此外,由添加促进剂引起的代谢流迁移也可以为肌苷产量的提高提供了一条新思路。工业生产上通常采用枯草芽孢杆菌发酵法生产肌苷,添加促进剂来改进肌苷发酵的方法成为了热门课题。至今已被研究的促进剂不多,如柠檬酸钠,葡萄糖酸钙等,但关于促进剂的组合添加方面仍没有报道。
发明内容
本发明目的在于提供提高肌苷产量的促进剂及其添加方法。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少一种:次黄嘌呤,NaF,CaCl₂,葡萄糖酸钙,柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少二种:次黄嘌呤,NaF,CaCl₂,葡萄糖酸钙,柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少三种:次黄嘌呤,NaF,CaCl₂,葡萄糖酸钙,柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少四种:次黄嘌呤,NaF,CaCl₂,葡萄糖酸钙,柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物:次黄嘌呤,NaF,CaCl₂,葡萄糖酸钙,柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂在培养基中的浓度为:次黄嘌呤为0.15%,NaFxa02xa0mg/L,CaCl₂xa010xa0mg/L,葡萄糖酸钙xa015xa0g/L,柠檬酸钠3xa0g/L。所述提高肌苷产量的促进剂的添加方法包括:将提高肌苷产量的促进剂加入培养基中,用含有该促进剂的培养基发酵培养枯草芽孢杆菌,从而生产肌苷。所述培养基为适宜枯草芽孢杆菌生长的常规培养基。本发明采用在培养基中添加不同的促进剂(柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、氟化钠、次黄嘌呤及氯化钙)来提高枯草芽孢杆菌发酵生产的肌苷产量。本发明发现组合添加不同的促进剂时,肌苷产量会比单一添加促进剂时的肌苷产量高。由于不同的促进剂对肌苷合成的作用机理不同,不同的促进剂间存在着优势互补和相互促进作用,组合添加时会呈现出叠加效应。本发明提出添加促进剂来改善肌苷产量的方法,组合添加比单一添加促进剂时更易引发枯草芽孢杆菌内代谢流的迁移,尤其当同时添加0.15%的次黄嘌呤、2xa0mg/L的氟化钠、10xa0mg/L的氯化钙及15xa0g/L的葡萄糖酸钙时,肌苷产量达到了14.01xa0g/L,是对照组肌苷产量的4.39倍。本发的提高了枯草芽孢杆菌生产肌苷的产率,降低肌苷单位生产成本,增强肌苷在市场上的竞争力。
附图说明
图1为柠檬酸钠对肌苷积累的影响。在图1中,横坐标柠檬酸钠浓度,单位为g/L,左纵坐标为肌苷产量,单位为g/L,右纵坐标为生物量,以发酵液在600xa0nm处的吸光度(OD₆₀₀)表示,曲线▲为肌苷产量,曲线●为生物量。图2为葡萄糖酸钙对肌苷积累的影响。在图2中,横坐标葡萄糖酸钙浓度,单位为g/L,左纵坐标为肌苷产量,单位为g/L,右纵坐标为生物量,以发酵液在600xa0nm处的吸光度(OD₆₀₀)表示,曲线▲为肌苷产量,曲线●为生物量。图3为NaF添加对肌苷发酵的影响。在图3中,横坐标NaF浓度,单位为mg/L,左纵坐标为肌苷产量,单位为g/L,右纵坐标为生物量,以发酵液在600xa0nm处的吸光度(OD₆₀₀)表示,曲线▲为肌苷产量,曲线●为生物量。图4为次黄嘌呤的添加对肌苷发酵的影响。在图4中,横坐标次黄嘌呤浓度(%),左纵坐标为肌苷产量,单位为g/L,右纵坐标为生物量,以发酵液在600xa0nm处的吸光度(OD₆₀₀)表示,曲线▲为肌苷产量,曲线●为生物量。图5为CaCl₂的添加对肌苷发酵的影响。在图5中,横坐标CaCl₂浓度,单位为mg/L,左纵坐标为肌苷产量,单位为g/L,右纵坐标为生物量,以发酵液在600xa0nm处的吸光度(OD₆₀₀)表示,曲线▲为肌苷产量,曲线●为生物量。图6为不同种类的促进剂对肌苷发酵的影响图。在图6中,横坐标为促进剂的不同组合,其含义分别为:A.xa0空白,B.xa02xa0mg/Lxa0NaF,C.xa00.15%次黄嘌呤,xa0D.xa02xa0mg/Lxa0NaFxa0+0.15%次黄嘌呤,E.xa00.15%次黄嘌呤+2xa0mg/Lxa0NaF+15xa0g/L葡萄糖酸钙;F.xa00.15%次黄嘌呤+2xa0mg/Lxa0NaF+10xa0mg/Lxa0CaCl₂+15xa0g/L葡萄糖酸钙;G.xa00.15%次黄嘌呤+2xa0mg/Lxa0NaF+3xa0g/L柠檬酸钠+15xa0g/L葡萄糖酸钙+10xa0mg/Lxa0CaCl₂;左纵坐标为相对肌苷产量(%),右纵坐标为相对蛋白和核酸产量,a为相对肌苷产量,b为相对蛋白含量,c为相对核酸含量。
具体实施方式
为使本领域的技术人员能进一步了解本发明,下面列举本发明实施例,并配合说明书附图,详细说明本发明的技术方案。需强调的:这些较佳实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举,故不用于限制本发明的保护范围。1.xa0材料:1.1xa0xa0菌种枯草芽孢杆菌xa0(Bacillusxa0subtilis)xa0,所述枯草芽孢杆菌xa0(Bacillusxa0subtilis)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(Chinaxa0Centerxa0ofxa0Industrialxa0Culturexa0Collection,xa0CICC),编号为CICC20201、CICC20943、CICC20944、CICC20947xa0、CICC20958中的一种或几种。本实施例优选CICC20958;1.2xa0xa0培养基(1)xa0斜面培养基:蛋白胨1.0xa0g,牛肉膏0.3xa0g,NaClxa00.5xa0g,琼脂2xa0g,水100xa0mL,pHxa07.2;(2)xa0种子培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉15,玉米浆12,NaClxa02.5,尿素2,pHxa07.2;(3)xa0摇瓶发酵初始培养基(g/L):葡萄糖140,玉米浆16,酵母粉15,尿素13,(NH₄)₂SO_4xa022,MgSO₄·7H₂Oxa0xa02,K₂HPO_4xa05,CaCO_3xa020(分消),pHxa07.0;(4)xa0摇瓶发酵培养基(g/L):葡萄糖140,玉米浆15,酵母膏17,尿素15,(NH₄)₂SO_4xa0xa020,MgSO₄·7H₂Oxa01,K₂HPO_4xa05,CaCO₃xa020(分消),pHxa07.0;2.xa0xa0方法:2.1.xa0xa0菌种活化:xa0将保存的菌种接种于斜面培养基上,37xa0°C恒温培养18xa0h;2.xa02xa0xa0液体种子培养:xa0从活化18xa0h的斜面上取一环菌种转接到装有25xa0mL种子培养基的250xa0mL三角瓶中,220xa0r/min,34xa0°C培养18xa0h;2.xa03xa0xa0液体发酵培养:取培养18xa0h的新鲜种子液,以5%接种量接入装有35xa0mL培养基的250xa0mL三角瓶中,220xa0r/min,34°C培养96xa0h;2.4xa0xa0测定方法:2.4.1xa0xa0生物量的测定;取0.2xa0mL的发酵液用蒸馏水稀释30倍,蒸馏水作空白,用分光光度计在660xa0nm波长处测定其吸光度值;2.4.2xa0xa0肌苷产量的测定:利用高效液相色谱法(HPLC法)进行测定;2.4.3xa0xa0残糖浓度的测定:取发酵液样品3500xa0r/min离心5xa0min,将上清液逐级稀释后取1mL,加入3xa0mL的DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂,沸水浴煮沸15xa0min显色,取出立即冷却,再用蒸馏水稀释至25xa0mL,于520xa0nm波长处测其吸光度值。样品糖浓度可从葡萄糖标准曲线计算可得;2.4.4xa0xa0氨基氮浓度的测定:采用甲醛滴定法:取一定体积的发酵液,离心后取上清,用0.05xa0mol/L的NaOH标准溶液滴定pH值为8.2,然后加入适当的甲醛溶液,混匀后继续用0.05xa0mol/L的NaOH标准溶液滴定pH值为9.2,记录所用NaOH溶液体积;2.4.5xa0xa0蛋白质浓度的测定:采用考马斯亮兰法:取一定体积的发酵液,先经过离心得到菌体,然后洗涤菌体,破壁后得到一定体积的裂解液,适当稀释后加入考马斯亮蓝,利用分光光度计在595xa0nm下测其吸光度值;2.4.6xa0xa0核酸浓度的测定:采用三氯乙酸抽提法:取一定体积的发酵液,离心后弃去上清,在沉淀中加入三氯乙酸充分搅拌,再离心除去上清;重复操作,沉淀加入三氯乙酸充分搅拌,并在80xa0°C水浴中搅拌抽提,冷却后再经过离心弃去沉淀,上清液用5%三氯乙酸(TCA)适当稀释,利用核酸蛋白快速测定仪测定其核酸浓度;2..5xa0数据分析方法:所有数据采用统计学软件SPSSxa017.0进行差异显著性分析(显著水平a=0.05);3xa0xa0结果与分析:3.1xa0xa0单一促进剂的选择及对肌苷发酵的影响;采用枯草芽孢杆菌;在发酵培养基中添加不同的促进剂;摇瓶培养条件为:34°C,25xa0mL/250xa0mL三角瓶,220xa0r/min,96xa0h。实验结果及对比情况见下图1-图3;从图1可知,添加适量的柠檬酸钠对枯草芽孢杆菌生物量、肌苷产量均有一定的提高作用,其中当添加量为3xa0g/L时,肌苷的发酵产量比对照组增加13.9%。从图2可以看出,添加适量的葡萄糖酸钙对枯草芽孢杆菌生物量、肌苷产量也有明显的提高作用,其中当添加量为15xa0g/L时,肌苷发酵产量比对照组增加27.8%。添加柠檬酸钠和葡萄糖酸钙能提高枯草芽孢杆菌生产肌苷的机理,是由于抑制了EMP途径而增大HMP途径引发代谢流迁移造成的结果;根据类似的调节机理,除了以上两种促进剂以外,NaF、次黄嘌呤和CaCl₂的添加对肌苷的积累也有显著的影响(见图3-图5);从图3可知,适量的添加NaF对肌苷产量具有显著的提高作用,当添加2xa0mg/L时,肌苷产量比对照组提高了23.9%;但过量的NaF会对枯草芽孢杆菌的生物量有较强的抑制作用。这可能是由于NaF是EMP途径的强烈抑制剂,EMP途径的抑制将导致代谢流在EMP,HMP途径和TCA循环之间的重新分配,故由此引发的代谢流迁移导致了肌苷合成途径代谢通量的增大,从而提高了肌苷产量;由图4可知,添加适量的次黄嘌呤对枯草芽孢杆菌的生长没有明显的促进作用,但对肌苷产量的积累却又显著地提高作用,尤其当添加0.15%次黄嘌呤时,肌苷产量比对照组提高了89.9%,这与次黄嘌呤是肌苷合成途径的前体物质有关。加入的次黄嘌呤为枯草芽孢杆菌提供了完整的嘌呤环,从而使得枯草芽孢杆菌便于通过补救途径大量合成肌苷;此外,添加不同浓度的CaCl₂对肌苷的积累也有一定的影响(见图5。从图5可知,适量添加氯化钙对枯草芽孢杆菌的生长以及肌苷的积累均有一定的促进作用。其中,当添加5xa0mg/L的CaCl₂时,生物量可以达到最大值;而当加入10xa0mg/L的CaCl₂时,肌苷产量达到最大值,比对照组的肌苷产量高出了23.1%。这主要是因为CaCl₂的添加可以提高5′-核苷酸酶的活力,而5′-核苷酸酶是肌苷合成途径中的关键酶,5′-核苷酸酶活力的增加有助于肌苷的积累,因此CaCl₂的适量添加可以提高肌苷的产量;3.2xa0xa0两种有效促进剂的复合添加对肌苷发酵的影响根据上述实验,申请人选择了柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、NaF、次黄嘌呤、CaCl₂这五种对肌苷积累有显著促进作用的有效促进剂。但由于不同的促进剂对肌苷积累的促进作用不同,复合添加不同组合的促进剂时也许存在着叠加效应,所以复合添加不同组合的促进剂时也许比添加单一的促进剂对肌苷产量的积累会有更明显的促进作用。两种不同组合的促进剂对肌苷积累的影响见表1;xa0表1xa0xa0两种不同组合的有效促进剂的添加对肌苷积累的影响:类型肌苷产量(g/L)OD₆₆₀残糖(g/L)氨基氮含量(g/L)蛋白含量(g/L)核酸含量(μg/mL)肌苷增加量(%)空白3.30±0.31^gef12.00±0.66^ef57.36±5.29^e0.81±0.020.50±0.04861.27±79.71???A3.09±0.23^fg23.30±1.12^a65.25±4.62^d0.97±0.040.51±0.04933.13±86.88-6.36B6.25±0.44^b20.95±0.79^b67.80±2.78^d0.40±0.010.20±0.01906.67±74.3689.39C6.34±0.19^b9.88±0.32^h106.14±8.96^a0.36±0.020.42±0.03439.97±42.1292.12D2.91±0.14^g22.72±1.42^a57.06±5.29^e0.28±0.010.24±0.01563.33±51.41-11.82E7.32±0.40^a21.61±3.74^a70.94±6.29^d0.32±0.010.45±0.021043.87±57.08121.82F6.44±0.44^b10.04±0.38^gh89.54±5.99^b0.56±0.020.65±0.02327.27±19.6195.15G3.57±0.06^def15.40±1.21^c84.59±2.04^bc0.51±0.020.55±0.03770.43±39.248.18H5.36±0.36^c11.09±0.54^fg79.87±4.29^c0.51±0.020.72±0.06408.77±33.1062.42I6.50±0.49^b14.39±0.90^cd47.19±0.85^e0.33±0.000.61±0.05641.43±25.9996.97J5.30±0.46^c13.26±0.92^de53.11±1.46^e0.16±0.000.59±0.03508.07±21.9360.61注:同一列数值后面的不同字母表示5%显著水平上的不同数值:A.xa0CaCl₂+NaF;B.xa0CaCl₂+次黄嘌呤;C.xa0CaCl₂+葡萄糖酸钙;D.xa0CaCl₂+柠檬酸钠;E.xa0NaF+次黄嘌呤;F.xa0NaF+葡萄糖酸钙;G.xa0NaF+柠檬酸钠;H.xa0次黄嘌呤+葡萄糖酸钙;I.xa0次黄嘌呤+柠檬酸钠;J.xa0葡萄糖酸钙+柠檬酸钠.从表1xa0可以看出,两种不同组合的有效促进剂的添加对肌苷的积累有着一定的影响。从生物量来看,含有次黄嘌呤(肌苷合成的前体物质)的添加组均能显著促进枯草芽孢杆菌的生长;葡糖糖的消耗速率与菌体生长有一定的关联,因此菌体的生物量越大,葡萄糖消耗得越多;同时肌苷产量也受两种不同组合的促进剂的显著影响,从表1.1可以看出,大多数添加组xa0(除添加10xa0mg/Lxa0的CaCl₂和2xa0mg/L的NaF;10xa0mg/Lxa0的CaCl₂和3xa0g/L的柠檬酸钠)xa0均能提高肌苷的产量,尤其当培养基中添加2xa0mg/L的NaF和0.15%次黄嘌呤时,肌苷产量达到了最大值7.32xa0g/L,是空白对照组的1.2倍,这也许是由于两种促进剂之间存在着优势互补和相互补充作用,实现肌苷产量的增加。同时从表1.1可以看出,发酵液中剩余的葡萄糖糖量越少,氨基氮含量也越少,由此说明菌体的生长耗糖量越多,氨基氮作为一种速效氮源供菌体生长被利用得也越多。由于肌苷合成代谢是一种经典的核苷酸代谢,故在肌苷产生菌枯草芽孢杆菌的代谢网络中,肌苷合成与胞内蛋白质及核酸含量可能存在着某些相关规律。从下表中还可以得到菌体内蛋白含量与核酸含量间存在着一定的负相关关系,这可能是由于核酸代谢在胞内与蛋白质合成存在着紧密关联,由于氮源在肌苷的合成中起着重要作用,蛋白质和核酸合成也需要一些氮源,肌苷和核酸含量较高说明用于肌苷和核酸合成的氮源利用得较多,而培养基中添加的氮源却是定量的,故被用于蛋白质合成的氮源利用较少,用于肌苷和核酸合成的氮源利用得就较多;3.3xa0xa0三种不同组合的有效促进剂的复合添加对肌苷发酵的影响由以上结果得出,两种不同组合的促进剂的添加有助于肌苷的合成。在此基础上,添加三种不同组合的促进剂,三种不同组合的促进剂对肌苷发酵的影响见表2。与对照组相比,肌苷产量和生物量均有较大的提升。同样,含有前体物质次黄嘌呤的添加组的菌体生物量均比其他组高,最大可以达到对照组的3倍;残糖量的多少与菌体生长呈一定的正相关关系,菌体生物量越大,糖耗得越多;更重要的是,从表2可以得出,三种不同组合的有效促进剂的添加可以显著提高肌苷的产量,其中当添加2xa0mg/Lxa0NaF,15xa0g/L葡萄糖酸钙和0.15%次黄嘌呤时,肌苷产量达到了9.17xa0g/L,大约是对照组肌苷产量的2.66倍,而且还可以看出添加三种不同组合的有效促进剂所得到的肌苷产量比添加两种促进剂时的肌苷产量高。同时从表1.2还可以看出从胞外氨基氮含量来分析,发酵液中剩余的葡萄糖糖量越少,氨基氮含量也越少,由此说明菌体的生长耗糖量越多,氨基氮作为一种速效氮源供菌体生长被利用得也越多。由于肌苷合成代谢是一种经典的核苷酸代谢,故在肌苷产生菌枯草芽孢杆菌的代谢网络中,肌苷合成与胞内蛋白质及核酸含量间可能存在着某些相关规律。由上图3.3可以看出肌苷产量高的实验组,其核酸含量也相对较高,而蛋白质含量却相对较低,与上述表1.1结果类似。表2xa0三种不同组合的有效促进剂的添加对肌苷积累的影响类型肌苷产量(g/L)OD₆₆₀残糖(g/L)氨基氮含量(g/L)蛋白含量(g/L)核酸含量xa0xa0xa0 (μg/mL)肌苷增加量 (%)空白3.45±0.28^f11.60±1.51^f66.81±5.44^a0.82±0.110.59±0.04693.00±59.80???A8.65±0.31^a32.36±1.49^bc30.25±2.50^h0.35±0.001.09±0.041195.00±93.18150.72B9.09±0.32^a35.41±0.45^a30.07±1.26^h0.67±0.051.57±0.091699.68±86.97163.48C9.17±0.49^a28.94±1.60^c53.94±3.25^f0.63±0.000.28±0.021726.95±68.93165.80D8.57±0.23^a32.70±1.40^ab29.22±2.33^h0.35±0.011.68±0.001355.77±98.03148.41E8.56±0.26^a18.98±0.17^e82.35±6.85^cd0.75±0.132.13±0.28848.63±75.04148.12F5.09±0.31^d23.00±1.35^d62.52±4.29^e0.79±0.061.33±0.821006.63±48.2147.54G3.76±0.24^ef16.99±1.02^e80.21±2.26^d0.58±0.031.75±0.501337.77±101.208.99H3.72±0.27^ef17.64±1.26^e84.30±8.25^bc0.75±0.041.86±0.21870.90±33.027.83I5.92±0.17^c28.83±0.63^c45.44±4.07^g0.37±0.020.46±0.011051.90±56.1971.59J3.68±0.29^f17.53±0.98^e92.39±7.28^b0.75±0.110.67±0.01748.97±71.416.67注:同一列数值后面的不同字母表示5%显著水平上的不同数值A.xa0次黄嘌呤+NaF+柠檬酸钠;B.次黄嘌呤+NaF+CaCl₂;C.次黄嘌呤+NaF+葡萄糖酸钙;D.次黄嘌呤+柠檬酸钠+CaCl₂;E次黄嘌呤+柠檬酸钠+葡萄糖酸钙;F.次黄嘌呤+CaCl₂+葡萄糖酸钙;G.xa0NaF+柠檬酸钠+CaCl₂;H.NaF+柠檬酸钠+葡萄糖酸钙;I.NaF+CaCl₂+葡萄糖酸钙;J.柠檬酸钠+CaCl₂+葡萄糖酸钙3.4xa0xa0四种和五种不同组合的有效促进剂的复合添加对肌苷发酵的影响在以上实验的基础上,当四种不同组合的促进剂添加到最初培养基时,肌苷产量比添加三种促进剂时的肌苷产量高(表3)。从表3可以看出,与对照组相比,大多数添加组(除培养基中添加2xa0mg/L的NaF,3xa0g/L的柠檬酸钠,15xa0g/L的葡萄糖酸钙和10xa0mg/L的CaCl₂)的生物量均有较大的提高,最大值是空白对照组的1.43倍,这也许是由于不同组合的促进剂间存在着某些交互作用,最终限制了菌体的生长。葡萄糖的消耗速率依然与菌体的生长呈一定的正相关关系,菌体的生物量越大,葡萄糖消耗得越多。更重要的是,肌苷产量比对照组有了更大的提高,最大值达到了14.04xa0g/L,大约是对照组的4.39倍;同时,可以看出肌苷产量的增加有一定的叠加效应,四种不同组合的添加物的肌苷产量比三种添加物的产量高,当五种促进剂全部添加到培养基中时,肌苷产量的增长相对减小,肌苷产量达到了9.06xa0g/L,大约是对照组的2.84倍。这可能是由于五种促进剂之间成分较为复杂,彼此之间有一定的交互作用,所以肌苷的产量没有继续增长。从胞外氨基氮含量来分析,发酵液中剩余的葡萄糖糖量越少,其氨基氮含量也越少,由此说明菌体的生长耗糖量越大,氨基氮作为一种速效氮源供菌体生长利用的也越多。同时,从胞内蛋白与核酸含量及肌苷相对含量来分析,除第五组外,肌苷合成的变化趋势和核酸的变化趋势基本一致,而蛋白含量与核酸和肌苷含量间的变化趋势没有那么明显,可能是由于培养基中添加的促进剂成分较为复杂,对肌苷的合成机理调节作用有较大差距,故规律没有那么明显。表3xa0四种和五种不同组合的有效促进剂的添加对肌苷积累的影响类型肌苷产量(g/L)OD₆₆₀残糖(g/L)氨基氮含量(g/L)蛋白含量(g/L)核酸含量(μg/mL)肌苷增加量(%)空白3.19±0.10^g14.29±0.93^de61.33±2.61^b0.72±0.080.69±0.04733.00±59.80???u3000A7.93±0.25^c20.65±0.86^a26.26±1.08^e0.12±0.011.14±0.04904.23±68.29148.59 B9.18±0.36^b16.74±0.50^c35.06±2.05^d0.84±0.070.87±0.07955.93±83.98187.77 C14.01±0.42^a14.77±0.55^d45.56±2.95^c0.82±0.020.92±0.08956.85±89.43339.18 D8.75±0.43^b17.25±0.62^c29.21±1.43^d0.19±0.010.86±0.05598.93±56.01174.29 E 4.32±0.31^f13.54±0.59^e73.78±4.28^a0.56±0.001.03±0.02906.60±39.1535.42 F9.06±0.49^b18.59±0.35^b34.85±1.27^d0.47±0.031.03±0.15746.33±74.26184.01 注:同一列数值后面的不同字母表示5%显著水平上的不同数值A次黄嘌+柠檬酸钠+NaF+CaCl₂;xa0B次黄嘌呤+NaF+柠檬酸钠+葡萄糖酸钙C次黄嘌呤+NaF+CaCl₂+葡萄糖酸钙;D次黄嘌呤+柠檬酸钠+葡萄糖酸钙+CaCl₂Exa0NaF+柠檬酸钠+葡萄糖酸钙+CaCl₂;F次黄嘌呤+NaF+柠檬酸钠+葡萄糖酸钙+CaCl₂添加适量的促进剂有助于肌苷产量的积累,但不同的促进剂对发酵影响不同,其作用原理可能是影响酶活力或促进生长或改变细胞膜渗透性或抗氧化或抗金属离子作用及协同作用等。其中,添加柠檬酸钠和葡萄糖酸钙能提高枯草芽孢杆菌生产肌苷的机理,是由于抑制了EMP途径而增大HMP途径引发代谢流迁移造成的结果。NaF是EMP途径的强烈抑制剂^[82],EMP途径的抑制将导致代谢流在EMP,HMP途径和TCA循环的重新分配,由此引发的代谢流迁移导致了肌苷合成途径代谢通量的增大,从而提高了肌苷产量。添加适量的次黄嘌呤对肌苷产量的积累却有显著地提高作用,这与次黄嘌呤是肌苷合成途径的前体物质^[83]有关。加入的次黄嘌呤为枯草芽孢杆菌提供了完整的嘌呤环,从而使得枯草芽孢杆菌便于通过补救途径大量合成肌苷。CaCl₂的添加可以提高5′-核苷酸酶的活力,而5′-核苷酸酶是肌苷合成途径中的关键酶,xa05′-核苷酸酶活力的增加有助于肌苷的积累^[86],因此CaCl₂的适量添加可以提高肌苷的产量。不同组合的促进剂的复合添加对肌苷产生菌枯草芽孢杆菌的肌苷积累更为明显。肌苷是一种初级代谢产物,由于不同的促进剂对肌苷的调节机制不一样,而且肌苷合成代谢途径中的关键酶之间也存在着一定的正协同作用^[26],因此也许更易引发代谢流的迁移,从而通过抑制EMP途径增大HMP途径的代谢流为肌苷合成提供了大量的前体PRPPxa0(5-磷酸核糖焦磷酸),进而实现了肌苷产量的提高。由于肌苷合成代谢是一种经典的核苷酸代谢,故在肌苷产生菌枯草芽孢杆菌的代谢网络中,肌苷合成与胞内蛋白质及核酸含量也可能存在着某些相关规律,见图6。在图6中,横轴字母含义为:A.xa0空白,B.xa02xa0mg/Lxa0NaF,C.xa00.15%次黄嘌呤,xa0D.xa02xa0mg/Lxa0NaFxa0+0.15%次黄嘌呤,E.xa00.15%次黄嘌呤+2xa0mg/Lxa0NaF+15xa0g/L葡萄糖酸钙;F.xa00.15%次黄嘌呤+2xa0mg/Lxa0NaF+10xa0mg/Lxa0CaCl₂+15xa0g/L葡萄糖酸钙;G.xa00.15%次黄嘌呤+2xa0mg/Lxa0NaF+3xa0g/L柠檬酸钠+15xa0g/L葡萄糖酸钙+10xa0mg/Lxa0CaCl_2。由图6可以看出,不同组合的促进剂对肌苷的积累有明显的促进作用,尤其当添加0.15%的次黄嘌呤,2xa0mg/Lxa0NaF,10xa0mg/LCaCl₂和15xa0g/L葡萄糖酸钙时,肌苷产量最高,达到了14.01xa0g/L,是空白对照组的4.39倍。由此,可以推断不同的促进剂对肌苷合成可能存在着一定的叠加效应,进而导致肌苷产量的增加。同时,由图6可以看出肌苷产量高的实验组,其核酸含量也相对较高,而蛋白质含量却相对较低,这条规律同前面结论相一致。这可能是由于肌苷是一种核苷,核苷是核苷酸的重要组成成分,而核苷酸的含量水平决定着核酸含量的高低;核酸代谢在胞内与蛋白质合成存在着紧密关联,由于氮源在肌苷的合成中起着重要作用,蛋白质和核酸合成也需要一些氮源,肌苷和核酸含量较高说明用于肌苷和核酸合成的氮源利用得较多,而培养基中添加的氮源却是定量的,故用于蛋白质合成的氮源利用较少。综上所述,本发明选出了几种有利于肌苷积累的促进剂,并确定了其最佳添加浓度,次黄嘌呤0.15%、NaFxa02xa0mg/L、CaCl_2xa010xa0mg/L、葡萄糖酸钙15xa0mg/L和柠檬酸钠3xa0g/L;当在初始发酵培养基中复合添加这些不同组合的有关代谢流迁移的促进剂时,又可以显著提高肌苷的产量,同时不同组合的促进剂之间存在着一定的叠加效应,尤其当添加0.15%次黄嘌呤,xa02xa0mg/Lxa0NaF、10xa0mg/Lxa0CaCl₂xa0和xa015xa0mg/Lxa0葡萄糖酸钙时,肌苷产量的提高最为显著,可以达到14.01xa0g/L,是空白对照组的4.39倍。因此,该方法为肌苷的工业生产提供了技术支持,为肌苷的发酵生产和高产菌株的选育可以提供一定的指导作用,在今后的实际应用中将会有重要的生产价值。